冠状病毒广泛存在于自然界，对人类生存和健康构成重大威胁。其中，中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS-CoV) 是一种对人类高度致病的冠状病毒，因而在研究领域内备受关注。MERS-CoV于 2012 年首次在中东地区被发现，并迅速传播至多国，病死率高达36%，远超目前流行的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）0.9%病死率。
2023年，Chen等人首次在穿山甲中发现一种MERS相关冠状病毒（MERSr-CoV）——MjHKU4r-CoV-1。其与MERS-CoV一样，可高效识别、结合人类细胞表面的hDPP4受体，并在人源细胞、人源类器官以及hDPP4转基因动物模型中展现出较强感染力。最近发表的系列文章证明一些来源于蝙蝠和水貂的MERSr-CoVs能够像新冠病毒一样使用ACE2感染人或哺乳动物的细胞，具有跨种传播感染人类的风险。因此，开发高效广谱冠状病毒融合抑制剂作为战略储备是国家重大需求。
近日，复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫健委/医科院重点实验室、上海市重大传染病毒和生物安全研究院的夏帅/陆路/姜世勃及其合作团队在Cell子刊 Cell Reports Medicine上在线发表题为“A MERS-related coronavirus circulating in pangolins exhibits strong fusogenicity in human cells and high sensitivity to fusion inhibitors”的研究论文。
该研究发现MjHKU4r-CoV-1感染人源细胞后，诱发大量合胞体形成，并伴随显著炎症反应，进一步提示该病毒可能具有较高的致病性。鉴于冠状病毒刺突（S）蛋白在病毒膜融合入侵靶细胞过程中的关键作用，研究团队系统比对了MjHKU4r-CoV-1-S与MERS-CoV-S功能域的同源性，并构建了MjHKU4r-CoV-1-S的细胞-细胞融合系统，从而全面解析其膜融合过程中的动力学特征。结果显示，MjHKU4r-CoV-1-S蛋白介导膜融合效率远高于HKU4-S和SARS-CoV-2-S (KP.2)组，这与MjHKU4r-CoV-1活病毒感染实验中大量合胞体形成现象高度一致。
图1 MjHKU4r-CoV-1 诱发合胞体形成和炎症因子表达
“合胞体形成”是部分高致病性冠状病毒在重症感染中常见的显著病理特征，通常与患者病情的严重程度密切相关。因此，本研究进一步探究了MjHKU4r-CoV-1-S介导合胞体形成后，靶细胞内转录表达谱的变化。结果显示，MjHKU4r-CoV-1-S蛋白介导的膜融合显著上调了多种炎症相关基因的表达（图2）。因此，阻断病毒膜融合过程不但可以阻断病毒的入侵，也可能是一种降低病毒诱发炎性损伤的有效策略 。
图2 MjHKU4r-S 介导的细胞融合而诱发显著的炎症反应
为了进一步揭示MjHKU4r-CoV-1-S蛋白介导膜融合的分子机制，研究团队与中国科学院生物物理研究所朱赟研究员团队合作，构建并表达了包含病毒HR1（989-1,064）和HR2（1,253-1,296）功能域的重组蛋白，并成功解析了病毒HR1-HR2功能域相互作用的晶体结构。结构显示三个HR1分子相互作用形成三聚体核心，三个HR2分子反向平行地作用于HR1三聚体表面的疏水性沟槽中，从而形成了经典的六螺旋（6-HB）结构。
结构显示，MjHKU4r-CoV-1-HR2中上大量疏水性氨基酸残基（如I1259, I1262, T1264, L1267, L1269等）负责与HR1疏水沟槽的结合。同时，HR2上E1272、S1286、K1291等氨基酸残基与HR1间存在着重要的电荷相互作用。此外，MjHKU4r-CoV-1 6-HB表现出与MERS-CoV 6-HB相似甚至可能更强的稳定性，并且在多个关键位点上优于SARS-CoV-2 6-HB。如MjHKU4r-CoV-1-HR1中Asn1021与HR2主链上的原子形成相互作用，这一特征同样存在于MERS-CoV中。然而，在SARS-CoV-2-HR1中对应的Ala942无法发挥类似作用。MjHKU4r-CoV-1-HR2的Tyr1287既能与HR1中Leu1010形成疏水作用，又能与Gln1014形成氢键，从而形成更稳定的六螺旋结构，而SARS-CoV-2-HR2中对应的Leu1197 却无法与HR1形成氢键作用（图3）。
图3 MjHKU4r-CoV-1 6-HB 的晶体结构
在MjHKU4r-CoV-1感染过程中，该6-HB结构的形成可有效拉近病毒膜和细胞膜的距离，从而介导病毒膜融合入侵靶细胞的过程。因此，MjHKU4r-CoV-1 6-HB结构的解析，不仅在原子层面清晰揭示了病毒膜融合入侵机制，也为后续针对6-HB靶点的抗病毒药物设计提供了重要结构基础。
基于MjHKU4r-6-HB的结构特征，该研究团队设计了系列HR2衍生肽。该类多肽可竞争性结合病毒HR1功能域，从而抑制病毒自身6-HB的形成，继而阻断了病毒的膜融合入侵过程。其中订书肽MjHKU4r-HR2P10（衍生于1,258–1,293）表现出最强的膜融合抑制活性。该订书肽的设计亮点在于：在其 1278E 和 1282Q 位置上（非HR1-HR2直接相互作用位点）引入了一对非天然氨基酸： (S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸 (S5)，从而在多肽内部形成稳定的全碳链烯烃交联结构（订书肽），在不直接影响与靶点HR1结合的同时，有效稳定自身α-螺旋构象，从而提升多肽整体的抗病毒效果（图4）。
图4 订书肽MjHKU4r-HR2P10的高效、广谱抗病毒活性
订书肽HR2P10在MjHKU4r-CoV-1-S介导的细胞-细胞融合模型和假病毒感染模型中展示出高效抑制活性，其半数抑制浓度（IC50）均在低纳摩尔水平（3.56~8.29 nM）。在MjHKU4r-CoV-1活病毒感染系统上，低浓度MjHKU4r-HR2P10 （40 nM）几乎完全抑制了病毒N蛋白表达，同时也间接抑制了由病毒感染而诱发的炎症反应。此外，MjHKU4r-HR2P10对其他β-HCoV（如SARS-CoV-2及其变异株等）均显示出显著的交叉抑制效果；并且在致死性HCoV-OC43感染小鼠模型中，MjHKU4r-HR2P10同样展现出良好的体内抗病毒保护作用。
总体上，该研究发现了MjHKU4r-CoV-1在感染过程中，可诱发显著合胞体形成和炎症反应等病原学特征，进而系统揭示了其S蛋白通过HR1-HR2功能域相互作用、形成6-HB而介导病毒高效膜融合入侵靶细胞的具体分子机制和结合细节；并以此为靶点，成功研发出系列HR2衍生活性多肽，其抑制病毒活性可达低纳摩尔水平。这些HR2衍生肽具有较好的开发应用前景，将为应对未来可能爆发的MERSr-CoV疫情提供重要防治手段。
图5 图文摘要（graphical abstract）
复旦大学基础医学院医学分子病毒学教育部/卫健委/医科院重点实验室、上海市重大传染病和生物安全研究院的夏帅青年研究员、陆路研究员、姜世勃教授、广州实验室的周鹏研究员以及中国科学院生物物理所朱赟研究员为本文共同通讯作者；复旦大学夏帅青年研究员、焦凡珂博士、王李珏博士、陆天予博士研究生以及广州实验室陈静博士为本文共同第一作者。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2025.102277
